Die meisten spätmittelalterlichen Gemälde, die heute zum Bestand des Germanischen Nationalmuseums gehören, sind ursprünglich in religiösem Kontext entstanden: Es handelt sich um Tafeln aus Altarwerken, um Epitaphien, Votivbilder, Reliquien- und Hausaltärchen. Daneben umfasst die Sammlung mehrere Porträts, die zu den frühesten Beispielen dieser im Spätmittelalter neu entstehenden Bildgattung gehören.

Einen der Sammlungsschwerpunkte bildet die fränkische Malerei von der Parler-Zeit bis zum Frühwerk Albrecht Dürers. Eine Schlüsselrolle nehmen hier Werke von Hans Pleydenwurff ein. Der Maler gab der deutschen Kunst in der zweiten Hälfte des 15. Jahrhunderts durch die Aneignung und Weiterentwicklung der Innovationen der niederländischen Malerei weitreichende neue Impulse. Zu dem bedeutenden Bestand seiner Gemälde im Museum zählen etwa die Darstellungen des hl. Dominikus und des hl. Thomas von Aquin. Dürers Lehrer Michael Wolgemut, der ebenfalls in der Sammlung vertreten ist, übernahm Pleydenwurffs Werkstatt und führte sie als einen der größten Malereibetriebe Frankens fort.

Ein zweiter Schwerpunkt der Sammlung liegt auf den Gemälden aus Köln sowie den Gebieten an Nieder-, Mittel- und Oberrhein. Höhepunkte bilden Spitzenwerke von Stefan Lochner und dessen Umkreis sowie die Verkündigungstafel von Konrad Witz mit ihrer um 1440 revolutionär neuen perspektivischen Raumauffassung und plastischen Figurengestaltung. Weitere bedeutende Werkgruppen stammen aus Schwaben, Bayern, Böhmen, Österreich, Tirol, Thüringen und Sachsen. Unter den Gemälden aus Bayern zählt der um 1450 geschaffene Kalvarienberg des Quirinus-Altars aus Kloster Tegernsee zum Bedeutendsten, was die spätmittelalterliche Malerei dieser Zeit hervorgebracht hat.

Viele der Gemälde sind Fragmente bzw. Teil eines ehemals größeren Werkzusammenhangs, dessen Rekonstruktion von höchster Bedeutung für das Verständnis und die Interpretation des überlieferten Bestandes ist. Auftraggeber und Stifter übten entscheidenden Einfluss auf das Erscheinungsbild und die inhaltliche Ausrichtung der Werke aus. Sie verewigten sich durch Wappen oder Stifterbildnisse auf den Gemälden, sind in einigen Fällen aber auch durch schriftliche Quellen nachweisbar.